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精密切断肺スライス:PCLSの準備とメンテナンス

臓器の代謝や病気を研究するために組織切片を使うという概念は、1920年代に登場し、生物医学研究の分野で重要なマイルストーンとなりました。組織を注意深く薄くスライスすることによって、組織の構造的完全性と機能的特性を保持することの大きな価値を認識しました。この画期的な技術により、研究者は肝臓、腎臓、肺などの特定の臓器を生体外で研究することが可能となり、代謝過程、薬物代謝、病気の組織機能への影響などを評価することができるようになりました。長年にわたり、組織スライス標本は進化を続け、臓器生理学の理解、創薬、個別化医療の進歩に道を切り開いてきました。この記事では、臓器の代謝と疾患の複雑さを解明する上で、組織切片法がどのような歴史的基盤、方法論、そして目覚ましい貢献をしてきたかを探ります。

精密切断肺スライス(PCLS)の作製

精密切断肺スライス(PCLS)の作製は、組織の構造と機能を確実に保存するために、いくつかの段階を踏みます。以下はPCLSの作成方法の概要です。

組織の採取

プロセスは、ヒト肺生検や動物モデルなどの適切な供給源から肺組織を注意深く採取することから始まります。組織の生存性を確保するため、虚血時間を最小限にするよう特別な注意が払われます。

組織の準備

肺組織が採取されたら、血液やゴミを除去するために生理的緩衝液で洗浄します。このステップは組織の完全性を維持し、汚染の可能性を最小限にするのに効果があります。

スライス

次に、精密切断装置(通常、ビブラトームまたはミクロトーム)を用いて、肺組織を薄い切片にスライスします。これらの器具は、通常150~400マイクロメートルの一貫した厚さのスライスを作成するために必要な制御と精度を提供します。

培養

スライス後、肺スライスを適切な培養培地を入れたインキュベーションチャンバーに注意深く移します。この培地は、必要な栄養素と酸素を供給しながら、スライスの生存率と代謝活性を維持します。

組織の安定化

スライスした組織は、温度と湿度が管理されたインキュベーションチャンバー内で平衡化させます。このステップにより、組織が安定し、スライスプロセス中に生じた潜在的ストレスから回復します。

実験的操作

PCLSが安定したら、研究目的に基づいて様々な実験的操作を行うことができます。これには、薬物、毒素、病原体など特定の物質への暴露が含まれ、肺組織への影響を調べることができます。PCLSはまた、炎症、組織リモデリング、ガス交換などの生理学的プロセスを調べるためにも使用できます。

プロセス全体を通して、PCLSの生存性と生理的妥当性を維持することが重要です。適切な培養液の使用、温度管理、慎重な取り扱いは、スライスが本来の特性や機能的特性を維持し、肺微小環境を正確に表現できるようにするのに効果的です。

PCLSにおけるアガロース注入・包埋の重要性

精密切断肺スライス(PCLS)の作製プロセスにおいて、アガロース注入とアガロース包埋は、本来の肺組織に近い健康で生存可能なスライスを得るために重要な役割を果たします。ここでは、PCLS作製におけるアガロース注入とその重要性について詳しく説明します。

 

アガロース注入では、スライスする前に肺組織に低融点アガロース溶液を含浸させておきます。このプロセスには複数の目的があります。まず、デリケートな肺組織をスライスする際に構造的な支持と安定性を与え、損傷を最小限に抑え、スライスの完全性を維持することです。注入されたアガロースは強固なマトリックスとして働き、スライス中に起こりうる組織の変形や歪みを防ぎます。

 

第二に、アガロースの注入は、一貫した再現性のあるスライス厚を得るのに効果的です。アガロース溶液はスライス工程でガイドの役割を果たし、スライス全体の正確で均一な厚みを保証します。この均一性は、正確なデータ解析と実験間の比較に極めて重要です。

 

アガロース包埋は、PCLSの安定性と生存性をさらに高めます。スライス後、個々の肺スライスを多孔性膜やろ紙などの支持マトリックス上に注意深く移し、固化したアガロースゲルに埋め込みます。この包埋ステップは機械的支持を与え、その後の取り扱いや実験操作中にスライスが動いたり剥がれたりするのを防ぎます。

 

PCLSを取り囲むアガロースゲルは、肺組織の生理的条件に近い微小環境を作り出します。アガロースゲルはスライスへの適切な水分補給、酸素供給、栄養供給を維持し、スライスの生存能と代謝活性を促進します。さらに、アガロースゲルはバリアーとして機能し、潜在的なせん断力からスライスを保護し、実験手順の間中、その構造的完全性を維持し続けます。

 

健康で機能的なPCLSを得るためには、アガロース注入とアガロース包埋が不可欠です。アガロース注入とアガロース包埋により、スライスは本来の構造、細胞間相互作用、生理的機能を維持し、呼吸器疾患の研究や様々な実験的アッセイを行うための代表的な生体外モデルとなります。

PCLSを用いたさらなる実験

精密切断肺スライス(PCLS)の生存期間は、肺組織由来の種、特定の実験条件、採用された保存技術など、いくつかの要因によって変化する可能性があります。一般に、PCLSは限られた期間、通常数時間から数日の間、生存可能で機能的であり続けることができます。

 

PCLSの生存率と寿命には、いくつかの要因が影響します。培養液による酸素と栄養の供給、適切な温度と湿度の維持、微生物汚染の防止は、スライスの生存性を維持するために極めて重要です。さらに、組織ソースの年齢と健康状態、および適切な保存技術の使用は、PCLSの生存期間に影響を与えます。

 

PCLSの生存期間を延ばすため、また、細胞の生存能力と機能をサポートするために栄養素、成長因子、抗生物質を添加した特殊な培養液を用います。適切な温度やガス交換など、管理された培養条件下でスライスを維持することも、その寿命延長に寄与します。

 

PCLSは限られた期間だけ生存能力を維持できますが、その機能的特性や実験操作に対する応答は、時間の経過とともに徐々に低下する可能性があることに注意することが重要です。したがって、正確で信頼できる結果を得るために、時間依存性の解析を行ったり、スライスの最適な生存期間内に実験を計画したりすることが多いです。

 

結局のところ、PCLSの生存期間は複数の要因に影響され、実験条件と保存技術に注意深く注意を払うことが、PCLSの生存率と機能性を最大化するのに助けとなります。実験を効果的に計画し、呼吸器疾患や関連研究領域について有意義な洞察を得るために、これらの要因を考慮する必要があります。

精密切断組織スライス(PCTS) - 推奨モデル

VF-510-0Z

振動ミクロトームCompresstome® VF-510-0Zは特許取得済みの圧縮技術によりビビリ・チャタリングなしで切片を作製し、急性組織上の多くの生存細胞を維持。良質な実験結果を保証します。

  • 従来のビブラトームの5倍の速さで切開し、ブレードを組織に当てる時間を短縮し、より良い切開を実現

  • Auto Zero-Zテクノロジーにより、Z軸のたわみを1 µm未満に低減

  • 持ち運びに便利な軽量設計

  • 完全自動化:切開+厚み調整

組織切片作成スライサー

研究室での実例

免疫療法研究におけるCompresstome®の使用

Astero Klampatsa博士(PhD)は、英国ロンドンがん研究所がん免疫療法のチームリーダーであり、英国キングス・カレッジ・ロンドンの上級講師です。中皮腫と肺癌に対する新規CAR T細胞療法の開発、および免疫療法に対する反応マーカーを同定するためのこれらの悪性腫瘍の免疫生物学に焦点を当てています。このウェビナーでは、Klampatsa博士が、Compresstome®を用いて、免疫療法研究のための生体外モデルとしてプレシジョンカット腫瘍スライス(PCTS)をどのように作成したかについて説明しています。

生体外アッセイサービスのための精密切断組織スライスの作成

Visikol社は、高度なイメージング、3D細胞培養アッセイ、デジタルパソロジーを活用し、創薬・開発プロセスを加速させることに特化した受託研究サービス企業です。このウェビナーでは、Visikol社が、肝臓損傷を研究するためのin vitro肝臓モデルの必要性について説明します。精密切断肝切片(PCLS)を作製するための標準的なアッセイフォーマットを実演し、Compresstome® VF-310-0Z振動ミクロトームが、治療間で意味のある比較ができる均一な組織スライスを作製するのに役立つことを説明します。PCLSを作成するためのCompresstome®の使い方を順を追って説明します。

免疫学と感染症:Compresstome® による精密切断肺スライス

Compresstome® は、精密切断肺スライス(PCLS)の作製に、世界中の研究者に広く使用されています。Compresstome® では、スライス前にアガロース包埋を行うことで、肺胞を開存させ、組織のコンプライアンスを向上させることができます。動画内では、肺の様々な免疫細胞の局在を可視化するために、Compresstome®でPCLSを切片化して免疫染色を行っています。このプロトコルは、様々な条件下で多くの異なる細胞タイプの位置と機能を可視化するために拡張することができます。

腫瘍のスライス:肺腫瘍スライス培養の試みからの考察

Tsilingiri博士は腫瘍免疫療法に取り組んでおり、Compresstome振動ミクロトームを使って、スライス培養における腫瘍組織と自己リンパ節細胞との相互作用を調べています。この研究は、EUが資金提供するコンソーシアムTumour-LNoC(Tumour-Lymph node on a chip)の枠組みの中で行われており、最終的な目標は、チップ上で転移プロセスを模倣し、転移細胞をリアルタイムでモニターすることです。

精密切断肺スライス(PCLS): 肺疾患研究のための新しい生体外モデル

Koziol-White博士は、約20年にわたり気道機能研究のために開発・利用してきた精密切断肺スライスシステムの多用途性を紹介しています。

肺線維症のメカニズムを探るための精密切断肺スライス(PCLS)

Claudia Loebel博士の研究は、肺損傷と線維化における初期上皮細胞分化のメカニズムを探るためのPCLSの開発に関わっています。

肺胞損傷後の幹細胞行動の時空間的協調性

Chioccioli 博士

  • 肺における新たな傷害応答メカニズムとしての肺胞幹細胞の運動性を記述し、幹細胞の運動性の特性を高い細胞分解能で明らかにしました。

  • 肺胞内および肺胞間の移動を含む、傷害後のAT2細胞の初期の非常に動的な挙動を説明しました。

  • AT2幹細胞の傷害応答に伴う、少なくとも3つの異なるAT2細胞の形態動態の出現を明らかにしました。

  • 低分子を用いてRho-associated protein kinase(ROCK)経路を阻害すると、傷害後のAT2幹細胞の運動性が有意に低下し、中間前駆細胞のマーカーとして知られるKrt8の発現が低下することを示しました

論文

PCLS(肝臓) 

Ko J, Wilkovitsch M, Oh J, Kohler RH, Bolli E, Pittet MJ, Vinegoni C, Sykes DB, Mikula H, Weissleder R, Carlson JCT. Spatiotemporal multiplexed immunofluorescence imaging of living cells and tissues with bioorthogonal cycling of fluorescent probes. Nat Biotechnol. 2022 Nov;40(11):1654-1662. Epub 2022 Jun 2. PMID: 35654978; PMCID: PMC9669087. PDFダウンロード

Liu P, Dodson M, Li H, Schmidlin CJ, Shakya A, Wei Y, Garcia JGN, Chapman E, Kiela PR, Zhang QY, White E, Ding X, Ooi A, Zhang DD. Non-canonical NRF2 activation promotes a pro-diabetic shift in hepatic glucose metabolism. Mol Metab. 2021 Sep;51:101243. Epub 2021 Apr 30. PMID: 33933676; PMCID: PMC8164084. PDFダウンロード

Weidinger A, Dungel P, Perlinger M, Singer K, Ghebes C, Duvigneau JC, Müllebner A, Schäfer U, Redl H, Kozlov AV. Experimental data suggesting that inflammation mediated rat liver mitochondrial dysfunction results from secondary hypoxia rather than from direct effects of inflammatory mediators. Front Physiol. 2013 Jun 7;4:138. PMID: 23760194; PMCID: PMC3675332. PDFダウンロード

PCLS(肺) 

Agraval H, Crue T, Schaunaman N, Numata M, Day BJ, Chu HW. Electronic Cigarette Exposure Increases the Severity of Influenza a Virus Infection via TRAIL Dysregulation in Human Precision-Cut Lung Slices. Int J Mol Sci. 2023 Feb 21;24(5):4295. PMID: 36901724; PMCID: PMC10002047. PDFダウンロード

Ahn S, Maarsingh H, Walker JK, Liu SW, Hegde A, Sumajit HC, Kahsai AW, Lefkowitz RJ. Allosteric modulator potentiates β2AR agonist-promoted bronchoprotection in asthma models. J Clin Invest. 2023 Jul 11:e167337. Epub ahead of print. PMID: 37432742. PDFダウンロード

Lam M, Lamanna E, Organ L, Donovan C, Bourke JE. Perspectives on precision cut lung slices-powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Front Pharmacol. 2023 May 16;14:1162889. PMID: 37261291; PMCID: PMC10228656. PDFダウンロード

PCTS(腸)

Aggarwal N, Deerhake ME, DiPalma D, Shahi SK, Gaggioli MR, Mangalam AK, Shinohara ML. Secreted osteopontin from CD4<sup>+</sup> T cells limits acute graft-versus-host disease. Cell Rep. 2021 Dec 28;37(13):110170. PMID: 34965439; PMCID: PMC8759344. PDFダウンロード

Lu P, Chen J, Zhang C, Saur D, Baer CE, Lifshitz LM, Fogarty KE, ZhuGe R. Oscillating calcium signals in smooth muscle cells underlie the persistent basal tone of internal anal sphincter. J Cell Physiol. 2021 Aug;236(8):5937-5952. Epub 2021 Jan 16. PMID: 33452672; PMCID: PMC8132622. PDFダウンロード

McCarthy CM, Allardyce JM, Hickey SE, Walsh MT, McGourty KD, Mulvihill JJE. Comparison of macroscale and microscale mechanical properties of fresh and fixed-frozen porcine colonic tissue. J Mech Behav Biomed Mater. 2023 Feb;138:105599. Epub 2022 Nov 26. PMID: 36462287. PDFダウンロード

PCTS(腎臓)

Charrin E, Dabaghie D, Sen I, Unnersjö-Jess D, Möller-Hackbarth K, Burmakin M, Mencke R, Zambrano S, Patrakka J, Olauson H. Soluble Klotho protects against glomerular injury through regulation of ER stress response. Commun Biol. 2023 Feb 22;6(1):208. PMID: 36813870; PMCID: PMC9947099. PDFダウンロード

Ferreira P, Vaja R, Lopes-Pires M, Crescente M, Yu H, Nüsing R, Liu B, Zhou Y, Yaqoob M, Zhang A, Rickman M, Longhurst H, White WE, Knowles RB, Chan MV, Warner TD, Want E, Kirkby NS, Mitchell JA. Renal Function Underpins the Cyclooxygenase-2: Asymmetric Dimethylarginine Axis in Mouse and Man. Kidney Int Rep. 2023 Mar 23;8(6):1231-1238. PMID: 37284684; PMCID: PMC10239776. PDFダウンロード

Han Z, Rao JS, Ramesh S, Hergesell J, Namsrai BE, Etheridge ML, Finger EB, Bischof JC. Model-Guided Design and Optimization of CPA Perfusion Protocols for Whole Organ Cryopreservation. Ann Biomed Eng. 2023 Jun 23. Epub ahead of print. PMID: 37351756. PDFダウンロード

PCTS (膵臓) 

Curiel-Garcia A, Decker-Farrell AR, Sastra SA, Olive KP. Generation of orthotopic patient- derived xenograft models for pancreatic cancer using tumor slices. STAR Protoc. 2022 Dec 16;3(4):101899. Epub 2022 Dec 12. PMID: 36595938; PMCID: PMC9768417. PDFダウンロード

PCTS(脾臓)

Barclay WE, Aggarwal N, Deerhake ME, Inoue M, Nonaka T, Nozaki K, Luzum NA, Miao EA, Shinohara ML. The AIM2 inflammasome is activated in astrocytes during the late phase of EAE. JCI Insight. 2022 Apr 22;7(8):e155563. PMID: 35451371; PMCID: PMC9089781. PDFダウンロード

Finetti F, Capitani N, Manganaro N, Tatangelo V, Libonati F, Panattoni G, Calaresu I, Ballerini L, Baldari CT, Patrussi L. Optimization of Organotypic Cultures of Mouse Spleen for Staining and Functional Assays. Front Immunol. 2020 Mar 24;11:471. PMID: 32265925; PMCID: PMC7105700. PDFダウンロード

Li S, Folkvord JM, Rakasz EG, Abdelaal HM, Wagstaff RK, Kovacs KJ, Kim HO, Sawahata R, MaWhinney S, Masopust D, Connick E, Skinner PJ. Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo. J Virol. 2016 Nov 28;90(24):11168-11180. PMID: 27707919; PMCID: PMC5126374. PDFダウンロード

振動ミクロトーム・ビブラトームのモデル

VF-510-0Z

全自動

アプリケーション

  • 電気生理学

  • スライス培養

  • イメージング

VF-210-0Z

半自動・手動厚み送り

アプリケーション

  • 電気生理学

  • イメージング

  • スライス培養

VF-300

全自動

アプリケーション

  • 電気生理学

  • イメージング

VF-800-0Z

大口径ビブラトーム、ヒト、霊長類、全臓器用

アプリケーション

  • 脳(固定)

  • 免疫組織化学

  • ハイスループット切片作製

回転式ミクロトームのモデル

RF-600

手動

アプリケーション

  • 病理組織学

  • 免疫組織化学

  • 植物研究

回転式ミクロトーム RF-600

RF-800

半自動、手動による厚さ調整

アプリケーション

  • 病理組織学

  • 免疫組織化学

  • 植物研究

RF-1000

全自動

アプリケーション

  • 病理組織学

  • 免疫組織化学

  • 植物研究

アプリケーション

臓器システム

脂肪
副腎
脳(固定)
脳(生体または急性)
脳幹
乳房
軟骨
小脳
心臓
腎臓
肝臓
リンパ節
筋肉
膵臓

実験

オルガノイド
材料&バイオエンジニアリング(ポリマー)
大サンプル(全臓器)切片化
イメージング
ハイスループットセクショニング
遺伝子シーケンス(単一細胞分離)
電気生理学
電子顕微鏡

動物モデル

鳥(ゼブラフィンチ)
ひよこ
魚類
カエル
モルモット
ヒト
マウス
霊長類
ブタ
ラット
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