Fura の処理方法は細胞タイプによって異なるため、多くの異なるプロトコルが存在します。以下に、単離心筋細胞にうまく機能するプロトコルをご紹介します。
Fura-2 染色の目的はカルシウムを測定することです。それには、カルシウムにバッファーし細胞の収縮性に影響を与えずに、良好なS/N比（Signal/Noise ratio）をカルシウム信号で達成することが不可欠です。 IonOptixシステムの PMT の感度により、ユーザーは Fura の少ないロードで良好な信号を取得できます。
ロードには、塩フォームではなく、Fura-2-AM エステルが好ましいです。 Fura のエステル型は、細胞膜全体に拡散し、細胞内では、エステラーゼが Fura 分子を脱エステル化します。これにより、Fura 分子は心筋から離れることができない塩に変わりますが、新しい Fura-2-AM は依然として拡散できます。このようにして、Fura-2 が蓄積されます。あまりにも多くの Fura が蓄積するので、長時間ロードしないように注意する必要があります。セル内のすべての Fura-2 を脱エステル化できるように、ロードの停止と測定の開始の間に十分な時間を確保してください。
プロトコル
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Fura-2-AM 粉末を DMSO に溶解します。 DMSOで最終濃度1 mM を目指します。 Fura は非常に低濃度で使用されるため、Pluronic などの洗剤は必要ありません。
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細胞懸濁液1 ml をエッペンドルフチューブに入れ、細胞の濃度に応じて、エッペンドルフチューブ内の溶液1 ml に細胞懸濁液を数滴加えます。
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エッペンドルフチューブに溶解した Fura-2-AM を追加します。 1〜2mM の最終濃度を目指します。
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エッペンドルフチューブを数回反転させることにより、フラと細胞懸濁液を混合します。
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エッペンドルフをアルミホイルで包み、光から保護します。
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チューブを室温で直立して保管します。
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インキュベーションの 20 分後、細胞を洗浄することによってローディングを停止します。
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チューブの底に細胞の小さなペレットがあるはずです。上清を取り除き、Fura を含まない新鮮な溶液を追加します。
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チューブを数回逆さにして、細胞を溶液と混合します（チューブの底を軽くたたいてペレットを取り除きます）。
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5 分後にこれを繰り返します。
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ロードを停止してから 20 分後に実験を開始しても安全です。これにより、脱エステル化に十分な時間が確保されます。
ポイント
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Fura が DMSO に溶解したら、アリコートを繰り返し凍結融解しないでください。 1日の実験に適した量のフラを小分けにしてください。 4〜5 個のローディングが可能なため、通常は 1 日あたり 10 μl で十分です。
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ローディング時間は、色素ローディングを増減するために変えることができます。
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マイクロモルの Fura で蛍光がまだ明るすぎる場合は、現時点で収縮に影響を与える可能性が低いため、これ以上濃度を下げる意味はありません。 その時点で、実験中に蛍光励起光の低減を開始することをお勧めします。