UPLC-MS分析サンプル前処理

Orange Science
4月24日
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超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS分析）とは

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）は、小さな粒子を封入したカラムを使用する液体クロマトグラフィーの分離能力と、質量分析の定量・定性能力を組み合わせた強力な分析技術です。UPLC-MS分析で正確で信頼性の高い結果を得るためには、適切なサンプル前処理が極めて重要です。

UPLC-MSサンプル前処理の主な目的は以下の通りです。

1. 潜在的な干渉の除去

2. 目的成分の濃縮

3. サンプルをUPLC-MSシステムに適合させる

4. アッセイ品質とプロセスの信頼性の向上

効果的なサンプル前処理は、感度の向上、クロマトグラフィ分離能の改善、分析装置の寿命延長につながります。

UPLC-MS分析サンプル前処理における主な考慮事項

試料の純度

高純度の溶媒を使用することは、コンタミネーションのリスクを低減するために極めて重要です。このようなコンタミネーションは、結果の質に影響を与える可能性があります。大きな生体分子は、分析前に溶液中に完全に分散させるために、追加の分解段階が必要になる場合があります。

濃縮

正確な分析を行うためには、サンプルの濃度を最適化することが重要です。分析法によっては、分析対象物を濃縮して感度を高めることができるものもあれば、サンプルを装置の最適範囲内に収めるために希釈が必要になるものもあります。

溶媒の選択

効果的なサンプル前処理には、適切な溶媒を選択することが重要です。選択した溶媒はサンプルとUPLC-MSシステムの両方に適合する必要があります。一般的な溶媒には、使用する分析物に応じて、水、ACN、MeOH、酢酸、酢酸アンモニウムなどがあります。

サンプルの安定性

サンプルの適切な保管と取り扱いは、調製中の劣化を防ぐために不可欠です。分析物の安定性を考慮し、適切な保存方法を使用します。分析物の損失源として考えられるのは、熱劣化、酸化、分析物の揮発性です。

サンプル前処理技術

液体-液体抽出 (LLE)

LLEは、溶解度の違いに基づいて、溶液や分析物を液相から別の混和しない液相に移すことです。これには以下のような利点があります。

- 分析物の濃縮、感度の向上
- マトリックス成分の除去、選択性の向上

液体-液体抽出に使用される一般的な溶媒には、n-ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、酢酸エチル、メチルtert-ブチルエーテルなどがあります。水性マトリックスのpHレベルは、塩基性分析物のpKaより2pH単位高く、または酸性分析物のpKaより2pH単位低く設定します。これは、分析物の99%が電荷を帯びていないことを保証するためです(1)。

固相抽出 (SPE)

固相抽出は、マトリックス成分を効果的に除去し、分析物を濃縮できる、より選択的なサンプル前処理技術です。SPEの主な検討事項は以下のとおりです。

- 適切なSPEカートリッジの選択
- ローディング、洗浄、溶出ステップの最適化
- 複数のサンプルで一貫した流速の確保

タンパク質沈殿

タンパク質沈殿は、シンプルで費用対効果の高いメソッドであり、特に生物学的サンプルに有用です。一般的な沈殿剤

- 水混和性有機溶媒（アセトニトリル、アセトン、エタノール、メタノール）
- 酸（トリクロロ酢酸、過塩素酸）
- 金属イオンと塩

アセトニトリル、トリクロロ酢酸、硫酸亜鉛は、それぞれのカテゴリーにおいてタンパク質の除去に最適です（沈殿剤と血漿の比率が2：1の場合、タンパク質の沈殿効率はそれぞれ96％以上、92％以上、91％以上）。

ろ過

サンプルのろ過は、UPLCシステムを詰まらせる可能性のある微粒子を除去するために非常に重要です。サンプルの特性に応じて、様々なフィルタータイプとポアサイズがあります。

誘導体化

誘導体化は、特定の分析物のクロマトグラフィ挙動または検出感度を向上させるために使用できます。一般的な誘導体化反応には、シアリル化、アシル化、アルキル化などがあります。

特定の試料タイプとその性質

生体サンプル

血液、血漿、血清のサンプルは通常、タンパク質沈殿またはSPEの方法を利用します。尿サンプルは希釈またはSPEが必要な場合があり、組織サンプルは通常、ホモジナイズに続いて抽出が必要です。

環境サンプル

水および土壌サンプルでは、対象分析物に応じてろ過、SPE、またはLLEが必要になる場合があります。環境汚染物質の抽出技術では、目的の化合物を単離するために多段階のプロセスが必要になることがよくあります。

食品および飲料サンプル

QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）は、食品サンプル前処理の一般的な方法です。塩抽出と分散SPEクリーンアップを組み合わせ、様々な分析物クラスに適応します。

医薬品サンプル

製剤サンプルは、剤形によって溶解、抽出、希釈が必要になる場合があります。賦形剤の干渉の可能性を考慮する必要があります。

サンプルバイアルと保管

バイアルの選択

UPLC-MSシステムに適合するオートサンプラーバイアルを選択します。サンプル量、溶媒適合性、吸着の可能性などの要因を考慮してください。クロロホルムやアセトニトリルを含むサンプルの場合は、可塑剤の汚染を防ぐためにガラスバイアルとガラスインサートを使用してください。

サンプルの保管

サンプルの完全性を維持するには、適切な保管条件が重要です。調製したサンプルを保管する際は、温度、光曝露、潜在的な劣化経路を考慮してください。

一般的な課題とトラブルシューティング

マトリックス効果はUPLC-MSメソッドにおける大きな制約です。複雑なサンプルマトリックス、特に生物学的なマトリックスは、イオンサプレッションやエンハンスメントを引き起こし、分析を妨害する可能性があります。このような影響を最小限に抑えるための戦略には次のようなものがあります。

- クロマトグラフィ分離の最適化
- 適切な内部標準物質の使用
- マトリックスマッチ検量線の導入
- サンプルクリーンアップ手順の強化

サンプル前処理における品質管理

以下のような品質管理対策を実施します。

- 内部標準物質の使用
- ブランクサンプルの分析
- サンプル前処理法の定期的なバリデーション

これらのステップにより、UPLC-MS分析の一貫性と信頼性が保証されます。

サンプル前処理の自動化

サンプル前処理工程の自動化により、再現性、精度、スループットを向上させることができる。例として以下が挙げられます。

- 自動リキッドハンドリングシステム
- ロボットによるサンプル前処理プラットフォーム
- サンプル前処理とUPLC-MSシステムのオンライン結合

ベストプラクティスとヒント

1. 特定のサンプルタイプと分析目標に合わせたサンプル前処理法

2. 汚染を最小限に抑えるため、高純度の溶媒と試薬を使用する。

3. サンプル前処理を補完するクロマトグラフィー分離の最適化

4. サンプル前処理装置およびUPLC-MS装置の定期的なメンテナンスとクリーニング

5. 効率と感度を向上させるために、サンプル前処理技術の小型化とオンラインカップリングを検討する。

UPLC-MS分析を成功させるには、効果的なサンプル前処理が不可欠です。サンプルの特性を注意深く考慮し、適切なテクニックを選択し、メソッドを最適化することで、分析結果の精度、感度、信頼性を大幅に向上させることができます。UPLC-MS技術が進歩し続ける中、革新的なサンプル前処理ストラテジーの研究が進めば、この強力な分析技術の能力はさらに向上するでしょう。

参考文献：

(1) Israel D. Souza, Maria Eugenia C. Queiroz. LCGC Supplements. Volume 39. Issue 11 (2021).

Organomation - 窒素エバポレーター

オレンジサイエンスでは世界的に有名なOrganomation社の窒素エバポレーターを取り扱っています。Organomation社は、窒素ブローダウン技術を中心とした窒素エバポレーター・窒素ブローダウン蒸発装置を専門としている機器開発メーカーです。1959年に設立され、60年以上にわたり、世界中の研究・試験機関向けに窒素エバポレーター・窒素蒸発装置を提供してきました。Organomation社の高品質な窒素エバポレーター装置は、世界中で信頼性が高く、メンテナンスの手間がかからない実験装置であると高く評価されています。また、耐用年数が長いため、今日の多忙な研究室にとって、非常に費用対効果の高いソリューションとなっています。

窒素エバポレーターとは、分析用サンプルの前処理によく使用される実験装置です。環境試験、農業、食品・飲料、医薬、品質保証、科学捜査、オイル・グリースなど、様々な業界で使用されており、質量分析を行う前にサンプルを乾燥・濃縮するために使用されます。試料は窒素エバポレーターに充填され、窒素ブローダウンが、時には熱と併用されながら、試料の水分を除去するために使用されます。

Organomationの卓上型窒素エバポレーターは、窒素ガスの穏やかな流れをサンプルに直接供給します。一定のガス流は、蒸気が飽和した空気層を押し流し、蒸気が液体に戻るのを防ぎます。これにより、過剰な溶媒蒸気の量が減少し、圧力が下がり、サンプルがより速く蒸発することが可能になります。これは、少量、揮発性、半揮発性のサンプルには特に重要です。

窒素ブローダウンは消耗品を必要としない方法であり、サンプルに非常に優しく、代替オプションと比較して非常に手頃な価格です。

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N-EVAPは調整可能な窒素ブローダウン技術を利用しており、窒素ガスを無駄にすることなく、サンプルへの窒素フローを完全にコントロールできます。柔軟性がN-EVAPの特徴です。他の少量サンプルエバポレーターと異なり、N-EVAPは、別々のヒートブロックを必要とせず、一度に数種類のバイアルやチューブを保持することができます。非加熱モデルだけでなく、ウォーターバスまたはドライビーズ付きの加熱モデルもあります。

N-EVAP

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MULTIVAPは、一度に多数のサンプルのバッチ濃縮に一貫性を提供します。チューブは、加熱された特注アルミブロックまたはウォーターバスに設置されます。窒素分配マニホールドはユニットとして昇降し、1回の動作で全サンプルへの蒸発を開始または停止します。

MULTIVAP

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MICROVAPは、96ウェルマイクロプレートや小ロット用に設計されたコンパクトな装置で、ライフサイエンスや製薬業界のお客様によく使用されています。サンプルは、サンプルチューブに合うように特注加工された加熱アルミニウムブロックに収まります。常温での蒸発用に、加熱なしのモデルもあります。

MICROVAP

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