STREX(ストレックス社)
細胞伸展装置/コーティング方法

販売しているストレッチチャンバーは、無菌状態ではなくまた細胞接着剤も塗布されておりません。その為チャンバーは最初に121℃で20分間のオートクレーブ処理が必要になり、その後細胞を播種する前に被膜を細胞外つ質でコーティングする必要があります。

コーティング方法:フィブロネクチン

  1. 0.05mg/mlのフィブロネクチンをPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に溶解し、フィブロネクチン溶液を調製します。

  2. ストレッチチャンバーを培養皿に入れ、フィブロネクチン溶液をチャンバーウェルに注ぎ、底面が完全に覆われるようにします。

  3. フィブロネクチンで処理したチャンバーを培養皿で37℃で少なくとも4時間インキュベートします。

  4. インキュベーターから培養皿を取り出し、ピペットまたは他の適切な機材を使用してチャンバーから残りの溶液を吸い上げます。

コーティング方法:コラーゲン

  1. 塩酸(pH3.0,1mM)の希釈液を準備しオートクレーブします。

  2. 1型コラーゲンをオートクレーブした塩酸で希釈します。

  3. ストレッチチャンバーを培養皿に入れ、コラーゲン溶液をチャンバーウェルに底面が完全に覆われるように注ぎます。

  4. 培養皿に蓋をして、37℃で少なくとも4時間以上インキュベートします。

  5. インキュベーターから培養皿を取り出し、しばらく静置します。その後、ピペットまたは他の適切な機材を使用して、チャンバーから残りの溶液を吸い上げます。

  6. 上記の手順の後に余分なコラーゲン溶液を除去するために、無血清培養液でチャンバーを2回すすいでください。

コーティング方法:ゼラチン

  1. ゼラチン粉末(2%)をPBSに溶解して、ゼラチン溶液を調製します。

  2. ストレッチチャンバーを培養皿に入れ、ゼラチン溶液をチャンバーウェルに注ぎ、底面が完全に覆われるようにします。

  3. 培養皿に蓋をして、37℃で少なくとも4時間以上インキュベートします。

  4. インキュベーターから培養皿を取り出し、ピペットまたは他の適切な機材を使用して、チャンバーから残りの溶液を吸い上げます。

伸展後の蛍光染色の方法

  1. 外科用ナイフ(約0.8×0.5 cm)を使用して、ストレッチチャンバーから細胞面を接合します。サイズは、手順2以降から使用する容器のサイズによって異なります。長辺を合わせるための接合伸展方向により、後から伸展方向が把握しやすくなります。

  2. 手順1でスプライシングしたメンブレンをPBS(-)の入った容器に入れます。 [カバーガラス付きの1×1チャンバー(フレームなし)を使用]

  3. PBS(-)で2回洗浄します。

  4. PBS(-)中の4%ホルマリン溶液で固定し、室温で5分間振動撹拌させます。

  5. 室温でPBS(-)で5分間、3回で洗浄します。

  6. PBS(-)中の0.1%TritonX-100、細胞膜を貫通させ、室温で5分間振動撹拌させます。

  7. 室温でPBS(-)で5分間、3回で洗浄します。

  8. 室温でPBS(-)で2%BSAをブロックし、30分間振動撹拌させます。

  9. 室温でPBS(-)の0.1%Tween20の一次抗体を30分間振動撹拌させます。

  10. 室温でPBS(-)液中の0.1%Tween20を5分間、3回で洗浄します。

  11. 室温でPBS(-)中の0.1%Tween20中の二次抗体を30分間振動撹拌させます。

  12. 室温でPBS(-)液中の0.1%Tween20を5分間、3回で洗浄します。

  13. 囲うようにスライドガラスに播種します。(Perma Fluor)–細胞膜側を下にします。

  14. 蛍光観察します。

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