電気培養

電気培養とは

電気培養とは、電気による刺激を与えながら細胞を培養する方法です。電気によって刺激を与えることによって身体内の状態を再現し細胞を培養することができ、長期培養の際に発生する筋細胞の脱分化を防ぐことが示されています。

電気培養には細胞の電気培養システムが用いられます。数日を必要とする長期の実験が可能になり、各動物から使用できる細胞の数が最大に活用することが可能となります。

電気培養とは

電気培養の例

ここでは、C2C12 ペーシング有無による写真の比較と、電気培養によるペーシング時の動画をご紹介します。

C2C12ペーシング有無の比較写真

C2C12 ペーシング無

電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング無

C2C12 ペーシング有

電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング有

Marloes Langelaan, Technical University Eindhover, The Netherlands

C2C12 ペーシング無

C2C12 ペーシング有

電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング無
電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング有

Nedachi et al, Am J Physiol Endocrinol Metab (2008)

C2C12ペーシング動画

​東北大学 医工学研究科 神崎研究室ご提供

​研究室リンク

http://www.ecei.tohoku.ac.jp/kanzaki/index.html

​論文リンク

https://www.physiology.org/doi/full/10.1152/ajpendo.90280.2008

電気培養の効果

電気培養することによって、長期培養の際に発生する筋細胞の脱分化を防ぐことが示されており、筋細胞の棒状形態、直線状形態を数日間維持できます。

 

継続的な電気刺激を与えたながら培養した細胞の多くは、72時間、収縮性がほとんど失われずに維持されます。タンパク質合成も維持され、窒素バランスも、少なくとも72時間維持されます。

 

電気刺激の効果は、最大7日間の研究で観察されています。 良好な成体ラット筋細胞では、オレンジサイエンスが取り扱うC-Pace / C-Dishシステムにより、一般的に70~80%の細胞を維持できます(ただし、細胞の50~60%を刺激するのに十分な電圧を使用することが、最も健康な細胞を最良の状態で維持することができます)。

電気培養での効果が見られる細胞

下記細胞で電気刺激による培養にて効果が見られております。

  • 心筋細胞

  • iPS心筋細胞

  • 骨格筋細胞

  • C2C12

  • 平滑筋細胞

  • 幹細胞

  • 心原性線維芽細胞 

  • 神経性線維芽細胞

  • 骨芽細胞​ 

  など

電気培養のアプリケーション

ここでは、C-Paceの開発の歴史から電気培養のアプリケーションを説明していきます。

細胞への電気培養刺激装置開発の歴史

いくつかの心臓の研究グループから依頼を受け、培養細胞を継続的に電気刺激する装置の研究を開始しました。Ralph KellyとThomas Smithのグループによる論文(Berger, et al. 1994)では、成人の心筋細胞を培養した状態でペーシングすることの利点が示されています。培養中の心筋細胞を機械的に活性化することで、収縮特性を保持したまま表現型を維持することができたのです。この研究は、後年、George CooperとPaul McDermottのグループによってより精緻化されました。継続的なペーシングによって表現型の保持が可能になっただけでなく(Kato, et al. 1995)、タンパク質合成が促進されることを示しました(Ivester, Kent, et al. 1993)(Ivester, Tuxworth, et al. 1995)。この研究結果とアイデアに基づき、マルチチャンネルペーサーを開発しました。

心筋;成体、新生児、胚、細胞株

C-Paceの初期のユーザーは、C-Paceユニットが筋細胞培養に有用であることを確認しました。例えば、興奮-収縮カップリングを研究する能力を維持しながら、アデノウイルスのトランスフェクションを用いたタンパク質の発現を可能にする安定した初代培養を確立するために使用することができます (Mills, et al. 2006)(Ahlers 2005). 細胞の継続的なペーシングは、シグナル伝達経路を良好に変化させますが、細胞の一部をアポトーシスに陥らせることもできます(Kuramochi, Guo, et al. 2006)(Kuramochi, Lim, et al. 2004)。培養ディッシュの表面が柔軟でないことが問題を引き起こしている可能性があるため、将来的には、生理学的条件をよりよく模倣するために、柔軟な基材を使用することが考えられます。

継続的な刺激とは別に、培養細胞の短期的な一括刺激にも利用され、様々な効果が得られています。例えば、カルモジュリンキナーゼ(W. Thiel, et al. 2008)や転写因子を細胞質から核に移行させる(Schroder, Byse and Satin 2009)ことが挙げられます。別の報告では、ウイルスのトランスフェクション中に継続的なペーシングを行うと、トランスフェクション効率が高まることが示されています(Rana, et al.2008)。 ペーシングで機械的活性を高めると、筋細胞の代謝が上昇します。大量の細胞のフィールド刺激は、筋細胞代謝の研究において有用なツールであることが示されています(Luiken, et al. 2001)。

C-Paceシステムを使って頻脈を模倣した興味深い研究も行われています。 Brundelらはこれを用いて、頻拍を誘発した際のHL1細胞株のストレス応答を調べました(Brundel, Henning, et al. 2006)(Brundel, Shiroshita-Takeshita, et al. 2006)。S. Nattelのグループは、24時間にわたる高周波ペーシングによって培養されたイヌの筋細胞の電気的リモデリングを示す研究内容を発表しました(Qi, et al. 2008)。これは、ペーシングがL型カルシウムチャネルを活性化し、細胞内カルシウムレベルを上昇させることによって初期効果を発揮することを示した研究内容のひとつです。L型カルシウムチャネルは、成体心筋細胞におけるカルシウムのホメオスタシスに明確に重要ですが、ペーシングが非駆動性細胞に対して大きな効果を発揮できることも示唆しています。

心原性線維芽細胞、幹細胞、骨髄細胞

Genoveseらの研究は、幹細胞分化のための電気刺激の可能性を示し、なぜ電気刺激が筋肉の表現型に強い影響を与えるのか、その手がかりとなるものでした。最初の研究で、研究グループは、電気刺激が幹細胞や線維芽細胞の心筋前駆細胞を誘導できることを示しました(J. Genovese, et al.2008)。それはおそらく、「筋肉の発達、分化、再生における重要な調節因子と考えられており」フォリスタチンのアップレギュレーションによって行われます(J. Genovese, et al.2009)。

骨格筋

C-Paceは、骨格筋細胞サンプル用にも使用されています。C2C12細胞株を用いて、ペーシングにより不完全分化の筋管にデノボ・サルコメア形成を誘導する論文がいくつか発表されています(Fujita, Nedachi and Kanzaki 2007)。また、完全に分化した筋管では、運動時に無傷の筋肉に見られるシグナル伝達プログラムに類似した肥大反応を得るために、刺激を用いることができます(Nedachi, Fujita and Kanzaki, American Journal of Physiology- Endocrinology And Metabolism 2008)(Nedachi, Hatakeyama, et al. 2009)。

その他の用途;神経細胞、骨芽細胞

多くの種類の細胞に電圧感受性チャンネルがあるため、継続的なペーシングの可能性はほぼ無限にあります。神経線維芽細胞では、電気刺激により胚性幹細胞の神経表現型への分化を調節することができます(Yamada, et al.2007)。C-Paceシステムは、神経線維芽細胞において、L型カルシウムチャネルを活性化することによりNMDA受容体の発現を誘導するために使用されています(Okutsu, et al.2008)。また、骨芽細胞の培養にも応用されており、低レベルの電流は人工表面への接着を助け、骨芽細胞の増殖を促進することができます(Ercan and Webster 2008)。

細胞への電気刺激の今後の展開

細胞への電気刺激を与えるC-Paceシステムの用途は、様々な実験に適用でき、今後さらに広がっていくと予想されます。私たちは、C-PaceとC-Dishesの設計を改良し、継続的な研究と新しい用途をサポートするよう努力します。この装置は科学者コミュニティとの密接な協力のもとに開発されましたが、今後もコミュニケーションをとりながら、皆様のニーズに合わせて設計を改善していくように努めたいと思います。

電気培養装置 - C-Pace EM

​ シーペース・システム(C-Pace EM)は、汎用培養ディッシュに適合したカーボン電極(C-Dish)により、本体(C-Pace EM)で予め設定したプロトコルで、電気刺激を与えながら細胞の培養ができるシステムです。

 本体には1枚の電源ボードが内蔵されておりますが、最大で8枚の電源ボードを増設することが可能で、1電源ボード毎(1ディッシュ毎)に異なるプロトコルで細胞への電気刺激が可能です。

下記細胞への電気刺激で効果が見られております。

  • 心筋細胞

  • iPS心筋細胞

  • 骨格筋細胞

  • C2C12

  • 平滑筋細胞

など

細胞電気刺激ペーシング培養
細胞電気刺激ペーシング培養 ディッシュ
心筋細胞・骨格筋細胞 電気刺激培養システム シーペース・システム(C-Pace EM)

​C-PaceとC-Dishの接続にはフラットケーブルを使用しますので、インキュベーターの扉にケーブルを挟んでも密閉性に問題はございません。

電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング無
電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング有

C2C12 ペーシング無

C2C12 ペーシング有

Marloes Langelaan, Technical University Eindhover, The Netherlands

電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング無
電気刺激ペーシング培養 C2C12 ペーシング有

C2C12 ペーシング無

C2C12 ペーシング有

Nedachi et al, Am J Physiol Endocrinol Metab (2008)

ペーシング動画(C2C12)

​東北大学 医工学研究科 神崎研究室ご提供

​研究室リンク

http://www.ecei.tohoku.ac.jp/kanzaki/index.html

​論文リンク

https://www.physiology.org/doi/full/10.1152/ajpendo.90280.2008

電気培養システム ​C-Pace EMの特徴

C-Pace EMは、培養インキュベーター内で大量の細胞を刺激し、機械的に伸展させるために設計されたマルチモード、マルチチャンネルの細胞電気刺激装置です。C-Pace EMは、従来のC-Pace EPに搭載されていた周波数の一定変化、周期的なオフビートの挿入、プログラム可能な周波数変化などの様々な電気生理学的機能をすべて備えています。 さらに、EMバージョンでは、C-Stretch電気機械刺激ユニットやC-Dish電極アセンブリを制御することができます。コントロールソフトウェア「C-Pace Navigator」が付属し、USB通信が可能です。C-Dish、C-Stretch、またはその両方と組み合わせることで、細胞培養システムを構成します。

 

プログラム可能なマルチステップシーケンスプロトコルで、ペーシングとストレッチングステップを設定でき、運動プロトコルに有用です。電気刺激としては、二相性刺激を与え、電極での電気分解を大幅に低減します。C Pace EMは、培養中の不整脈や運動プロトコルの影響を調べたい研究者の方々のご要望に応じ、柔軟なペーシングプロトコルを設計しています。ゲート出力とAux出力により、急性期ペーサーとして使用する場合の機能性を高めることができます。

・ 不整脈プロトコル

一定間隔でのオフビートパルス挿入

・ 運動プロトコル

周波数と時間を個別にプログラム可能な複数のパルス列を実行

・ イレギュラーペーシング

指定された周波数のランダムな変動(設定可能な割合の範囲内)および平均有効レートの保証

・ 外部トリガー

TTL 'advance' 入力で次のパルス列に変更、または TTL 'pulse' 入力で個々のパルスをトリガー

・ C-ストレッチの制御

C-ストレッチは、最大6つのフレキシブルな培養ウェルに電気機械的な刺激を与えるために使用します。

拡張、保持、収縮の各フェーズを調整できる台形ストレッチ波形は、収縮期と拡張期の滞留時間を制限するのに有効です。

不整脈の模倣に有効な、ランダムな変動を含むストレッチプロトコル中の任意のタイミングで発生する電気パルスのプログラム。

・ C-Pace Navigator

WindowsPCで使用できるソフトウェアで、使いやすいGUIで刺激プロトコルを管理

​C-Pace EM 仕様・寸法

電圧

最大40V

パルス幅

0.4 ~ 10 msec

周期

0.010~99 Hz

刺激ステップ数

最大5ステップ
(*Sequenceモード)

重量

3.9 Kg

​C-Pace EM 仕様・寸法

​C-Pace EM ナビゲーターソフトウェア

​C-Pace EM ナビゲーターソフトウェア

C-Pace EMにはナビゲーターソフトウェアが付属しており、ユーザーフレンドリーなインターフェースでC-DishとC-Stretchの両方を操作しながら使用いただけます。

特長

  • どのチャンネルにおいても、ストレッチと電気のパラメーターがシンプルに調整可能

  • シンプルなペーシング手順のため、予め登録された基本的なプロトコル

  • 調整可能な、拡張、停止、収縮フェイズでの台形波形

  • 運動のルーティンや病原コンディションの模倣のための、カスタムされた特定のプロトコル

C-Pace EM 関連項目

C-Dish(カーボン電極)

細胞電気刺激ペーシング培養 C-Dish(カーボン電極)

電源ボード

電源ボード

​使用方法

細胞電気刺激システムの使い方

​C-Paceを使用するには、培養ディッシュにセットして使用するC-Dish(別売り)が必要となります。C-Dishは4~24well用があり、適合する培養ディッシュは下の製品ページからご確認下さい。

​C-Paceには最大8枚まで電源ボードを増設でき、異なるプロトコルの設定が可能です。旧モデルの電源ボードも引き続きご提供可能です。

​ フロントパネルから簡単に電気刺激プロトコルの設定が可能です。電圧、ヘルツ、パルス幅はもちろん、複数ステップ、不整脈を模倣するランダムでの設定も可能です。

​筋細胞への電気刺激の効果を簡単に説明します。

IonOptix社のC-Pace開発の歴史から、現在までのアプリケーション(細胞)の使用実績を紹介します。

​C-Paceシステムに関する、お問合せをまとめました。

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