ミトコンドリア代謝解析の生組織切片作製
- 6 日前
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ミトコンドリア代謝を、生組織の微小環境を保ったまま解析するために
Compresstome®で作製した精密生組織切片を、リアルタイム代謝解析へ
ミトコンドリア代謝の研究では、培養細胞や単離ミトコンドリアを用いた解析が広く行われています。一方、これらのモデルだけでは、組織に存在する複数の細胞種、細胞外マトリックス、局所的な栄養・酸素環境、細胞間相互作用を十分に捉えられない場合があります。
生きた組織を一定の厚さに切り出した精密切断組織スライス（Precision-Cut Tissue Slices：PCTS）は、組織構築と局所環境の一部を維持したまま、ex vivoで機能を評価できる3Dモデルです。Agilent Seahorse XF Flexなどを用いることで、組織切片の酸素消費速度（OCR）をリアルタイムに測定し、ミトコンドリア呼吸を機能的に評価できます。
ただし、組織切片の厚さや大きさ、切断時の損傷、生存性、測定までの時間にばらつきがあると、得られる代謝データにも影響します。Precisionary社のビブラトーム「Compresstome®」は、ミトコンドリア代謝解析に使用する均一な生組織切片の作製をサポートし、下流の測定に適した再現性の高い試料調製を支援します。
ミトコンドリア代謝とは
ミトコンドリアは、TCA回路や電子伝達系、酸化的リン酸化を介してATPを産生し、細胞の増殖、分化、恒常性維持、ストレス応答などを支えています。ミトコンドリア代謝の変化や機能障害は、がん、神経変性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、炎症、老化など、幅広い研究領域で重要なテーマとなっています。
ミトコンドリアの量や形態を観察するだけでは、実際にどの程度呼吸しているか、薬剤や刺激に対してどのように応答するかを十分に評価できません。そのため、酸素消費速度などを測定する機能解析が用いられます。
主な指標 | 何を示すか | 研究で得られる情報の例 |
|---|---|---|
OCR（Oxygen Consumption Rate） | 酸素消費速度。主にミトコンドリア呼吸の指標 | 基礎呼吸、ATP産生に関連する呼吸、最大呼吸、予備呼吸能、プロトンリーク、非ミトコンドリア呼吸 |
ECAR（Extracellular Acidification Rate）／PER（Proton Efflux Rate） | 細胞外酸性化またはプロトン排出。解糖系活性の評価に用いられる指標 | 解糖への依存、代謝表現型、刺激や薬剤による代謝シフト |
ATP産生速度 | ミトコンドリア呼吸と解糖によるATP産生 | エネルギー産生経路の寄与や変化 |
※OCR、ECAR／PER、ATP産生速度を測定するのは代謝解析装置です。Compresstome®は、その測定に用いる生組織切片を作製する前処理装置です。
なぜ、培養細胞だけでなく「生組織切片」で代謝を解析するのか
ミトコンドリア代謝は、細胞種だけでなく、周囲の細胞、細胞外マトリックス、酸素分圧、栄養基質、炎症性シグナルなどの影響を受けます。生組織切片を用いることで、単離によって失われる組織内の関係性を一部維持しながら、機能的な代謝応答を評価できます。
解析モデル | 主な利点 | 主な注意点 |
|---|---|---|
2D培養細胞 | 条件を制御しやすく、比較やスクリーニングを行いやすい | 組織構築や多細胞間相互作用を再現しにくい |
単離ミトコンドリア | 電子伝達系などを直接的に解析しやすい | 単離操作の影響を受け、細胞・組織環境が失われる |
生組織切片 | 組織構築、複数細胞種、局所環境を一部保持できる | 切片厚、面積、生存性、拡散、正規化の標準化が必要。測定値は原則として切片全体の統合信号 |
生組織切片はin vivoを完全に再現するものではありませんが、2D培養と動物個体の間をつなぐex vivoモデルとして、疾患メカニズム研究、薬効評価、毒性評価、バイオマーカー探索などに利用できます。
生組織切片の品質がミトコンドリア代謝データを左右します
リアルタイム代謝解析では、測定装置だけでなく、その前段階にある組織切片作製の品質管理が重要です。
切片厚と組織径のばらつき
組織量が異なればOCRの絶対値も変化します。また、切片が厚すぎると、中心部への酸素、栄養、薬剤モジュレーターの拡散が制限される可能性があります。比較実験では、切片厚と組織パンチ径をそろえることが重要です。
切断時の細胞・組織損傷
ブレードの不要な上下振動、試料の押しつぶし、チャターマークなどは、切片表面の細胞や組織構造に影響する可能性があります。ミトコンドリア機能を測定する場合は、形態だけでなく、細胞膜とミトコンドリア膜の健全性にも配慮が必要です。
組織採取から測定までの時間
生組織は採取後から虚血や低酸素の影響を受けます。組織に適した温度、バッファー、酸素化条件を用い、できるだけ速やかに切片を作製することが重要です。
プレート内での位置と正規化
組織パンチが測定部の中心から外れたり、キャプチャリングの下に挟まったりすると、OCRが低く測定される場合があります。組織面積、総タンパク質量、重量、ベースラインなど、研究目的に合った正規化方法も検討する必要があります。
Compresstome®がミトコンドリア代謝解析の試料調製を支える理由
1．アガロース包埋で軟らかい組織を安定化
Compresstome®では、組織を低融点アガロースで包埋し、周囲から支持した状態で切断します。脳、肝臓、腫瘍、リンパ節など、軟らかく変形しやすい組織でも、試料の移動や傾きを抑えながら均一な切片を作製しやすくなります。
2．Auto Zero-Z®テクノロジー
Auto Zero-Z®テクノロジーは、切断ブレードのZ軸方向の不要な振動を抑えるよう調整されています。切片表面のチャタリングや細胞損傷を軽減し、生組織を用いる機能解析に適した切片作製を支援します。
3．凍結せず、組織に適したバッファー中で切断
Compresstome®は、新鮮な未固定組織をバッファー中で切断できます。ミトコンドリア代謝のリアルタイム解析では、固定や凍結を行わず、組織に応じた冷却・酸素化バッファー中で速やかに切片を作製することが重要です。
4．自動切断による条件の標準化
VF-510-0Zは、切断と厚み送りを自動化した振動ミクロトームです。切片厚、前進速度、振動条件を設定し、同一条件で繰り返し切片を作製できるため、群間比較や複数日にわたる実験の標準化に役立ちます。
5．目的領域を選んだ組織パンチへ展開
均一なスライスを作製した後、生検パンチを用いて測定プレートに適した大きさの組織ディスクを作製できます。脳の特定領域、腫瘍内部と辺縁部、リンパ節内の対象領域など、採取位置を定義した代謝研究にも応用できます。
国内共同デモ：皮下腫瘍・リンパ節の生組織切片を用いたOCR解析
京都大学大学院医学研究科附属 がん免疫総合研究センター（CCII）とプライムテック株式会社による共同デモでは、皮下腫瘍およびリンパ節を対象に、Compresstome®とAgilent Seahorseを組み合わせたワークフローが試されました。
項目 | 共同デモの概要 |
|---|---|
対象組織 | 皮下腫瘍、リンパ節 |
試料調製 | Compresstome®による生組織切片作製 |
下流解析 | Agilent Seahorseによる酸素消費速度（OCR）解析 |
確認できたこと | Seahorseアッセイに用いる生組織切片を作製し、OCR測定へつなげられることを確認 |
このデモは、腫瘍組織や免疫組織の構築を可能な範囲で維持しながら、ミトコンドリア呼吸を機能的に評価するex vivoワークフローの可能性を示しています。がん免疫、免疫代謝、薬剤応答、腫瘍微小環境などの研究への展開が考えられます。
T細胞の代謝を研究する場合の重要な解釈
組織切片から得られるOCRは、原則として切片内に存在する複数の細胞種を合わせた統合信号です。そのため、皮下腫瘍やリンパ節に含まれるT細胞のミトコンドリア代謝に着目する場合でも、組織切片のOCRだけからT細胞固有の寄与を断定することはできません。
T細胞特異的な解釈が必要な場合は、細胞分離後の代謝解析、フローサイトメトリー、免疫染色、細胞除去・阻害実験、空間解析などを組み合わせ、組織全体のOCRと相補的に評価する実験設計が重要です。
Agilentアプリケーションノート：ラット脳組織のリアルタイム代謝解析
Agilent Technologiesのアプリケーションノートでは、Compresstome® VF-510-0Z、Agilent Seahorse XF Flex、Seahorse XF Flex 3D Capture Microplate-L、Seahorse XF 3D Mito Stress Test Kitを組み合わせた脳組織解析ワークフローが紹介されています。
アプリケーションノートの主な条件
ラット脳を、冷却・酸素化した人工脳脊髄液（aCSF）中で処理
Compresstome® VF-510-0Zを使用し、Speed 2、Oscillation 4で切片を作製
厚さ200 µmの脳組織スライスから、直径1 mm、1.5 mm、2 mmの組織パンチを作製
組織パンチを3D Capture Microplate-Lへ配置し、OCRを測定
総タンパク質量、組織面積、ベースラインなどによる正規化方法を検討
この検討では、1～2 mmの範囲で組織パンチ径とOCRシグナルに直線的な関係が示されました。また、厚さ200 µm、直径2 mmのラット脳組織ディスクを用いて、基礎OCRとミトコンドリアモジュレーターに対する応答が取得されています。
3D Capture Microplate-Lのサンプルチャンバーは深さ250 µm、直径3.15 mmであり、同資料では組織を厚さ250 µm以下、直径3 mm以下に収め、ガスと栄養の交換に余裕を持たせることが推奨されています。Seahorse XFアッセイ用の生組織切片については、150～200 µmの均一な厚さが推奨範囲として示されています。
これらの数値と装置設定は、ラット脳および同資料の測定系における一例です。最適な切片厚、パンチ径、バッファー、回復時間、薬剤濃度、正規化方法は、組織種と研究目的ごとに検討してください。
Compresstome®からリアルタイム代謝解析までの5ステップ
STEP 1．組織と解析目的を定義
対象臓器、動物種、病態モデル、解析したい領域、必要な切片厚、下流の測定プレート仕様を確認します。比較したい代謝パラメーターと正規化方法も事前に設計します。
STEP 2．新鮮組織を速やかに回収・維持
組織種に適した温度、pH、浸透圧、エネルギー基質、酸素化条件を設定します。切り出し後の時間をできるだけ短くし、組織の代謝状態を維持します。
STEP 3．アガロース包埋して均一に切断
組織をトリミングして低融点アガロースで包埋し、Compresstome®で切断します。切片厚、前進速度、振動条件は、組織の硬さと目的に合わせて最適化します。
STEP 4．組織パンチを作製してプレートへ配置
必要に応じて生検パンチで大きさをそろえ、測定ウェルの中央に配置します。組織の挟み込みや気泡がないことを確認し、測定前に適切な回復・平衡化を行います。
STEP 5．OCRを測定し、品質管理・正規化
基礎呼吸や薬剤応答を測定し、酸素・pHシグナル、未処理組織コントロール、外れ値を確認します。総タンパク質量、組織面積、重量、ベースラインなどから、研究目的に適した方法でデータを正規化します。
ミトコンドリア代謝研究への主な応用
がん・がん免疫・免疫代謝
腫瘍組織のミトコンドリア呼吸と解糖の評価
腫瘍微小環境における代謝応答の研究
リンパ節や腫瘍組織を用いた免疫代謝研究
抗がん剤、免疫療法、代謝阻害剤への応答評価
T細胞を含む免疫細胞と腫瘍細胞の相互作用研究
神経科学・神経変性疾患
大脳皮質、海馬、白質など領域別のミトコンドリア呼吸評価
老化、認知機能低下、神経変性疾患における代謝機能研究
急性脳スライスを用いた薬理応答・毒性評価
神経細胞とグリア細胞の代謝カップリング研究
創薬・安全性・毒性研究
薬剤によるミトコンドリア毒性の評価
精密切断肝スライス、腎スライスなどを用いた臓器毒性研究
用量・時間依存的な代謝応答の評価
2D培養では捉えにくい組織レベルの薬効評価
代謝性疾患・循環器研究
肝臓、脂肪、筋肉、心臓などのエネルギー代謝研究
糖・脂質・アミノ酸利用の変化に関する研究
虚血、低酸素、炎症によるミトコンドリア機能変化の評価
オルガノイド・3Dモデル
オルガノイドやスフェロイドのサイズをそろえるための切片作製
組織工学モデルの内部領域を含む代謝解析
2D培養とin vivoの間をつなぐ3Dモデルの機能評価
※実際の適用可否と推奨条件は、試料の大きさ、硬さ、構造、培養条件、測定プレートによって異なります。
ミトコンドリア代謝解析用の生組織切片作製に推奨されるVF-510-0Z
Agilentの脳組織アプリケーションノートで使用されたCompresstome® VF-510-0Zは、生組織と固定組織の両方に対応する全自動ビブラトームです。通常サイズの脳、肝臓、腫瘍、リンパ節などから、精密切断組織スライスを作製する用途に適しています。
項目 | VF-510-0Z |
|---|---|
切断モード | 全自動 |
厚み送り | 自動 |
対応試料 | 新鮮組織、固定組織 |
試料チューブ径 | 15.5 mm、20 mm |
最小切片厚のメーカー公表値 | 10 µm |
主な関連用途 | 精密切断組織スライス、急性脳スライス、スライス培養、電気生理学、イメージング、代謝解析用試料調製 |
主な技術 | アガロース包埋、圧縮技術、Auto Zero-Z® |
※実用的な切片厚と切片品質は、組織種、試料状態、包埋方法、ブレード、切断速度、振動条件によって異なります。大型試料や複数試料の処理にはVF-800-0Zも候補となります。
導入・デモ相談時に下記情報をお知らせください
対象組織・臓器と動物種
新鮮組織／固定組織の別
試料のおおよその大きさと硬さ
希望する切片厚と組織パンチ径
1回の実験で必要な切片数
下流の解析方法と使用予定のプレート
現在使用しているバッファー、温度、酸素化条件
現在の切片作製で困っている点
これらの情報をもとに、適したCompresstome®モデルと切片作製条件をご案内します。
よくあるご質問
OCRを測定すると、ミトコンドリア代謝の何が分かりますか？
OCRは酸素消費速度を示し、ミトコンドリア呼吸を機能的に評価する主要な指標です。ミトストレステストでは、基礎呼吸、ATP産生に関連する呼吸、最大呼吸、予備呼吸能、プロトンリーク、非ミトコンドリア呼吸などを評価できます。
Compresstome®だけでOCRを測定できますか？
いいえ。Compresstome®は組織切片を作製する振動ミクロトームです。OCRの測定にはAgilent Seahorse XFなどの代謝解析装置が必要です。Compresstome®は、測定に用いる厚さと大きさのそろった生組織切片の作製を担います。
Seahorse解析用の組織切片は何µmが適していますか？
すべての組織に共通する切片厚はありません。Agilentのラット脳組織アプリケーションノートでは厚さ200 µmの切片が使用され、150～200 µmが推奨範囲として示されています。使用するプレートの寸法、組織の呼吸活性、酸素・薬剤の拡散を考慮し、組織種ごとに最適化してください。
腫瘍やリンパ節のミトコンドリア代謝解析にも使用できますか？
はい。Compresstome®は、腫瘍やリンパ節を含む生組織切片の作製に利用できます。国内共同デモでは、皮下腫瘍とリンパ節から生組織切片を作製し、SeahorseによるOCR測定へつなげられることが確認されました。実験条件は組織種と研究目的に応じた最適化が必要です。
組織切片のOCRからT細胞だけの代謝を評価できますか？
組織切片のOCRは、原則として切片内の複数細胞種を合わせた信号です。T細胞固有の代謝を評価する場合は、細胞分離後の解析、フローサイトメトリー、免疫染色、細胞除去・阻害実験などを併用し、組織全体のOCRと組み合わせて解釈してください。
固定組織や凍結組織をリアルタイム代謝解析に使用できますか？
Compresstome®は固定組織も切断できますが、生きた組織のミトコンドリア代謝を測定する場合は、新鮮で未固定の組織を使用します。固定や凍結は細胞膜・ミトコンドリア膜の完全性を損ない、リアルタイム機能解析には適しません。
組織切片のOCRはどのように正規化しますか？
総タンパク質量、組織面積、直径、重量、ベースラインシグナルなどが候補です。最適な方法は、組織の構成、細胞外マトリックス量、試料サイズのばらつき、研究目的によって異なります。正規化方法は実験開始前に定め、全群で統一してください。
オルガノイドの代謝解析用切片も作製できますか？
試料のサイズや硬さ、包埋条件によっては、オルガノイドやその他の3Dモデルの切片作製にも利用できます。測定プレートの寸法と必要な切片厚を確認し、事前に条件検討を行うことをおすすめします。
デモや切片作製条件について相談できますか？
はい。対象組織、希望切片厚、下流の解析方法、現在の課題をお知らせください。装置選定やデモについてオレンジサイエンスまでご相談いただけます。
ミトコンドリア代謝解析に適した生組織切片作製をご相談ください
生組織を用いた代謝解析では、切片作製は単なる前処理ではありません。切片厚、組織量、生存性、切断面、処理時間の一貫性が、OCRのばらつきや薬剤応答の解釈に影響します。
オレンジサイエンスでは、対象組織、希望する切片厚、処理数、下流解析を確認したうえで、適したCompresstome®モデルをご提案します。ミトコンドリア代謝、Seahorseアッセイ、精密切断組織スライスのための試料調製をご検討中の方は、お気軽にお問い合わせください。
※Compresstome®は研究用途の装置です。Agilent Seahorse XFはAgilent Technologies社の代謝解析プラットフォームです。
参考文献・関連資料
Agilent Technologies, A Superior System for Real-Time Metabolic Analysis with Brain Tissue and Other 3D Models, 5994-8309EN. 英語版アプリケーションノート（日本語版）
Precisionary Instruments, Precisionary Instruments Partners with Agilent to Advance Live Tissue Metabolic Analysis
Underwood E, et al. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 2020;10:13179. 論文
Fried NT, et al. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. Am J Physiol Cell Physiol. 2014;307. 論文
Qi G, et al. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2021;2:100559. 論文
組織切片作製ソリューション
Precisionary社のビブラトームを使用して、組織研究用の健康で生存可能な組織スライスを作成します。
組織研究のための高品質で生存可能な組織スライスの入手
Precisionary Instruments 社のビブラトームは、サンプルの生理学的完全性を維持する正確で生存可能な組織切片を作成するように設計されており、下流の解析において最も信頼性の高いデータを確保します。
高精度振動ミクロトーム
Compresstome® VF-510-0Z は、サンプルの生存性と健全性を保ちながら、薄い組織スライスを作成するように設計されており、脳や肺の組織研究に理想的です。この完全自動システムは、研究で正確な結果を得るために重要な、組織切片の生理的完全性を確実に維持します。
アプリケーション
VF-510-0Zは、正確で迅速な切片作製を実現し、組織・細胞の健全性を保ちながら、組織研究のための最高品質の結果をサポートします。
アプリケーション
実験別
臓器
動物モデル
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アガロース包埋
アガロース包埋とは、Compresstome©振動型マイクロトームで組織切片を切り出す前に、組織試料をアガロース溶液で包埋することです。切片作製にかかる時間はほんのわずかで、より健康的で滑らかな組織スライドを作製できます。
Auto Zero-Z®テクノロジー
振動ヘッドは、Z軸方向の振動をなくすように正確に調整されています。Auto Zero-Z®テクノロジーは、生きた組織サンプルの表面細胞へのダメージを軽減し、薄切片のチャタリングを低減してイメージング結果を向上させます。
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